BioNow

Для опытов использовали две модельные системы: слияние липидных везикул и слияние плоской модельной мембраны с липидными везикулами. За процессом слияния можно следить с помощью светового или электронного микроскопа, но чаще проводят прямой количественный анализ слияния внутренних компартментов или смешивания липидов, образующих везикулы

Пусть одна группа везикул содержит дипиколиновую кислоту, а другая – Tb3 +. При слиянии везикул и смешивании их содержимого эти два реагента быстро образуют сильно флуоресцирующий ТЬ3 + – дипиколинатный комплекс, что и позволяет проводить количественные измерения. За процессом смешивания липидов можно следить, измеряя эффективность переноса энергии электронного возбуждения между флуоресцирующими липидными молекулами, принадлежащими до смешивания разным везикулам. Эти методы позволяют различать агрегацию везикул и их истинное слияние.

Замечательной особенностью однослойных фосфолипидных везикул является то, что самопроизвольно они сливаются с большим трудом. Хотя между противоположными фосфолипидными бислоями существует вандерваальсово взаимодействие, между ними имеется также сильное электростатическое отталкивание, особенно в том случае, когда везикулы содержат отрицательно заряженные фосфолипиды. Например, везикулы, содержащие фосфатидилсерин, не будут агрегировать, поскольку существует значительный энергетический барьер, препятствующий образованию плотного контакта между мембранами, необходимого для образования комплекса. Все фосфолипиды, включая цвиттерионные липиды, связываются с водой, и для того, чтобы два близлежащих бислоя могли вступить в прямой контакт, этот поляризованный водный слой на поверхности липидного бислоя должен быть удален. Дегидратация фосфолипидов требует больших энергетических затрат, и роль агентов, облегчающих слияние мембран, состоит, в частности, в снижении этого энергетического барьера. Некоторые фосфолипиды ги-дратированы в меньшей степени, чем другие, и образуют везикулы, которые сливаются гораздо легче. Например, везикулы, состоящие из фосфатидилэтаноламина / фосфатидилсерина, сливаются эффективнее, чем везикулы из фосфатидилхолина / фосфатидилсерина.Векзикулы, состоящие из фосфатидилэтаноламина, слипаются друг с другом сильнее, чем везикулы из фосфатидилхолина, из-за различий в степени гидратации.

Агенты, облегчающие слияние мембран

1. Кальций. При добавлении Са2+ к везикулам, содержащим анионные липиды, часто происходит их слияние. Если везикулы состоят только из анионных липидов, добавление Са2+ приводит к разрушению везикул; если же анионные липиды смешаны с нейтральными, такими, как фосфатидилэтанола-мин, то происходит слияние. Для этого необходимы высокие концентрации Са2+, который не может быть заменен Mg2+. Са2+ нейтрализует отрицательный поверхностный заряд, создаваемый анионными липидами, и облегчает агрегацию везикул. Кроме того, Са2+ особенно эффективен при образовании мостика между анионными фосфолипидами в близлежащих бислоях благодаря формированию прочного комплекса Саг. Это приводит к дегидратации липидов, т. е. выталкиванию воды из пространства между противоположными бислоями. Mg2 + стабилизирует агрегацию везикул, но обычно не стабилизирует тесный контакт дегидратированных противоположных бислоев, причем эффективность его действия зависит от липидного содержания везикул.

Деформация, происходящая при адгезии везикул, приводит к напряжению в мембранах, которое снимается при слиянии. Слияние облегчается при наличии дефектов упаковки липидного бислоя, возникающих из-за каких-то локальных флуктуации или образующихся на границе раздела фаз в присутствии Са2+. Как правило, четкой корреляции между условиями, приводящими к слиянию везикул, и условиями, облегчающими крупномасштабное разделение фаз липидов, не обнаруживается. Са2 + – индуцируемое слияние часто сопровождается лизисом.

Са2+ способствует также слиянию везикул из анионных липидов с плоскими мембранами. Однако в этом случае необходимым условием является наличие осмотического градиента или на везикуле, или на плоской мембране. По-видимому, слияние стимулируется благодаря дополнительным механическим напряжениям. Высказывалось предположение, что осмотическое набухание является движущей силой слияния мембран in vivo, но пока это не подтверждено экспериментально.

Протоколы полимеразной цепной реакции. Постановка реакции с использованием фирменного набора(система SYBgreen)
Для ПЦР в качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3 cavmut – плазмидный вектор, содержащий кДНК мутантного кавеолина (P132L) человека (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1(исх.конц. 31 мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen (10000 кратный раствор) и taq-полимеразу. Фермент поставляется фирмой Sigma в наборе c буфер ...

Труды Галилея и создание экспериментального естествознания
Галилей родился в семье обедневшего дворянина в городе Пизе (недалеко от Флоренции). Убедившись в бесплодии схоластической учености он углубился в математические науки. Став в дальнейшем профессором математики Падуанского университета, ученый развернул активную научно- исследовательскую деятельность, особенно в области механики и астрон ...

Морфологическая зрелость
Для определения биологического возраста иногда используют так называемую "общую морфологическую зрелость", хотя этот критерий менее четкий, чем предыдущий, и менее информативный. Общая морфологическая зрелость оценивается по весоростовым соотношениям и изменением пропорций тела, однако информативность данного критерия невелик ...