Материалы » Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК » Проведение ПЦР в разных объемах смеси в пробирках

Проведение ПЦР в разных объемах смеси в пробирках
Страница 1

Перед проведением реакции в микроплашках ПЦР провели в пробирках Eppendorf с общим объемом смеси 5, 4, 3, 2 и 1 мкл (исходная концентрация ДНК – 7 нг) в среде масла. Подобная модель миниатюризации реакции может дать ответ на вопрос в каком минимальном объеме возможно прохождение амплификации и насколько эффективно. Данные о приросте сигнала флуоресценции будут своеобразным контролем для реакции смеси соответствующего объема в изготовленных микропланшетах.

ПЦР-смесь заливали минеральным маслом объемом 10 мкл. В результате получали капельки образца в среде масла (рис. 17 А).

Рис. 17.

Пробирки с разным объемом ПЦР смеси в среде минерального масла. А – схематическое изображение. Б – реальное изображение капли в объективе камеры.

В качестве контроля служила смесь без матрицы в соответствующих объемах. Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» производства «ДНК-технология». Реакцию ставили с использованием зондов SYBRgreen и TaqMan по протоколам описанным в пункте 2.3.2 и 2.3.3 соответственно. После амплификации из каждой пробы отбирали по 1 мкл на измерения в стрипах. Тем самым измеряли флуоресценцию в одинаковых объемах. По результатам этих измерений судили об эффективности амплификации в каждой капле. Результаты детектировали на описанном выше оборудовании в пробирках и в перенесенных в микропланшетах (объем анализируемой смеси одинаков во всех пяти случаях – 1 мкл) (рис. 18.).

А Б

Рис 18.

Лунка микропланшета с образцом объемом 1 мкл. А – в разрезе, Б – вид в объектив камеры (фотография).

Результаты измерений представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2.

Объем смеси

(мкл)

Образцы с матрицей

(у.е. флуоресценции)  

Образцы без матрицы

(у.е. флуоресценции)

Приращение сигнала

(у.е. флуоресценции)

Образцы с матрицей

(у.е. флуоресценции)

Образцы без матрицы

(у.е. флуоресценции)  

Приращение сигнала

(у.е. флуоресценции)

в микропробирках

в объеме 1 мкл в пластиковых микрострипах

1

130,43

119,12

11,31

59,44

31,38

28,06

2

129,82

111,55

18,25

50,89

44,01

6,88

3

176,10

150,34

25,76

63,01

59,86

3,14

4

162,77

155,13

7,64

65,70

55,88

9,82

5

161,55

149,38

12,17

70,00

52,70

17,30

Страницы: 1 2


Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в 8% ПААГ
Для приготовления геля было использовано. gels 1 2 H2O (мл) 3,7 7,4 30%АА/bAA (29:1) (мл) 1,87 3,74 5х ТВЕ (мл) 1,4 2,8 TEMED (мкл) 20 40 10% PSA (мкл) 27 54 Собирали кассету с вертикальными пластинками. В гель вносили полимеризаторы, перемешивали и заливали 4.2 мл меж ...

Патогенность микроорганизмов
Патогенность (от греч. pathos, болезнь + genos, рождение) - это потенциальная способность микроорганизмов вызывать заболевания, которая является видовым генетически детерминированным признаком. Факторы патогенности Патогенность как биологический признак бактерий реализуется через их три свойства: инфекциозность, инвазивность и токсиге ...

Плеотропное действие генов. Пример и схема
Плеотропия – (множественное деление гена) – один ген влияет на 2 признака и более, т.к. контролирует синтез ферментов, участвующих в различных обменных процессов в кл и в организме в целом. Т – белая, ts – бежевая: 1) Tta*tsts=Tts,Tts,tats,tsta; 2) Tts*tats=Tta,Tts,tsta,tsts. ...