BioNow

Принцип метода, основные определения и формулы. Центрифугирование применяется для разделения неоднородных жидких сред.

Центрифугирование позволяет разделить смесь, состоящую из двух или более компонентов с разной удельной плотностью, если по крайней мере один из этих компонентов - жидкость.

Разделение веществ с помощью центрифугирования основано на разном поведении частиц в центробежном поле. В центробежном поле частицы, имеющие разную плотность, форму или размеры, осаждаются с разной скоростью.

Скорость осаждения, или седиментации, зависит от центробежного ускорения (G), прямо пропорционального угловой скорости ротора (, в рад/с) и расстоянию между частицей и осью вращения (г, в см): G = 2 • г. Поскольку один оборот ротора составляет 2л радиан, угловую скорость ротора в оборотах в минуту (об. /мин) можно записать так: v = 2p60 (об. /мин), а центробежное ускорение тогда будет равно: G =4p2r/3600 (об. /мин) 2.

Центробежное ускорение обычно выражается в единицах g {гравитационная постоянная, равная 980 см*с-1) и называется относительным центробежным, ускорением (ОЦУ), т.е. ОЦУ=4p2r/3600*980 (об. /мин) 2 или ОЦУ = 1,11*10-5*r (об. /мин) 2 (*)

На основании уравнения (*) Доулом и Котциасом была составлена номограмма, выражающая зависимость ОЦУ от скорости вращения ротора и радиуса г - среднего радиуса вращения столбика жидкости в центрифужной пробирке (т.е. расстояния от оси вращения до середины столбика жидкости).

Номограмма для расчета центробежного ускорения

Для определения G соединяют прямой линией значения радиуса и скорости вращения ротора на крайних шкалах; точка пересечения этой прямой со средней шкалой дает искомую величину центробежного ускорения. Следует иметь в виду, что правая колонка цифр шкалы G соответствует правой колонке цифр шкалы скорости вращения ротора; левая - левой.

Скорость седиментации сферических частиц зависит не только от центробежного ускорения, но и от плотности и радиуса самих частиц и от вязкости среды суспендирования. Время осаждения сферической частицы в жидкой среде от мениска жидкости до дна центрифужной пробирки обратно пропорционально скорости седиментации и определяется следующим уравнением (закон Стокса, видоизмененный Сведбергом и Никольсом):

где t - время седиментации, с; h - вязкость среды, Паскаль • секунда; гч - радиус частицы, см; рч - плотность частицы (удельный вес); p - плотность среды (жидкости) или удельный вес; гм - расстояние от оси вращения до мениска жидкости, см; гд - расстояние от оси вращения до дна пробирки, см.

Как следует из уравнения (**), при заданной скорости вращения ротора время, необходимое для осаждения гомогенных сферических частиц, обратно пропорционально квадрату их радиусов и разности плотностей частиц и среды и прямо пропорционально вязкости среды. Поэтому смесь гетерогенных, приблизительно сферических частиц, различающихся по плотности и (или) размерам, можно выделить либо за счет разного времени осаждения их на дно пробирки при данном ускорении, либо за счет распределения седиментирующих частиц вдоль пробирки, устанавливающегося через определенный промежуток времени. При разделении веществ необходимо учитывать и такие важные факторы, как плотность и вязкость среды.

Описанными методами можно выделять клеточные органеллы из гомогенатов тканей. Основные компоненты клетки осаждаются в следующей последовательности: сначала целые клетки и их фрагменты, затем ядра, хлоропласты, митохондрии, лизосомы (или другие микротельца), микросомы (фрагменты гладкой и шероховатой эндоплазматической сети) и, наконец, рибосомы.

Осаждение несферических частиц не подчиняется уравнению (**), поэтому частицы одинаковой массы, но различной формы осаждаются при разных скоростях. Эта особенность используется при исследовании конформации макромолекул.

Препаративное центрифугирование заключается в выделении биологического материала для последующих биохимических исследований.

С помощью препаративного центрифугирования выделяют большое количество клеточных частиц для изучения их морфологии, структуры и биологической активности. Метод применяется для выделения таких биологических макромолекул, как ДНК и белки, из предварительно очищенных препаратов.

Аналитическое центрифугирование применяется главным образом для изучения чистых и практически чистых препаратов макромолекул или частиц, например, рибосом. В данном случае используется небольшое количество материала, а седиментация исследуемых частиц непрерывно регистрируется с помощью специальных оптических систем. Метод позволяет получать данные о чистоте, молекулярной массе и структуре материала.

Лизогенные конверсии (превращения)
Как уже отмечалось, при лизогенизации клетка-хозяин приобретает устойчивость к данному фагу, а также способность продуцировать зрелые частицы этого фага. Однако этим не ограничиваются изменения, вызванные фагом при лизогенизации. Многочисленными опытами на микроорганизмах самых различных систематических групп было показано, что при лизо ...

Лизогения и её биологическое значение
При изучении явления бактериофагии исследователи обратили внимание на то, что иногда встречаются культуры микроорганизмов, которые содержат фаги, хотя на эти культуры фагами и не воздействовали. Явление фагоносительства получило название лизогении. Оно было описано одним из основоположников учения о бактериофагах — Д'Эреллем, который с ...

Труды Вернадского
Центральным в этой концепции является понятие о живом веществе, которое В.И. Вернадский определяет как совокупность живых организмов. Кроме растений и животных, В.И. Вернадский включает сюда и человечество, влияние которого на геохимические процессы отличается от воздействия остальных живых существ, во-первых, своей интенсивностью, увел ...