BioNow

Кинетическая кривая.

Флуоресцентные красители обеспечивают флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Механизмы генерации репортерной флуоресценции различаются в зависимости от типа real-time PCR.

Кинетическая кривая PCR в координатах "Уровень репортерной флуоресценции — цикл амплификации" имеет сигмоидную форму (Рис. 5).

Рис 5

. Пример кинетических кривых RealTime PCR (по материалам www.molbiol.ru).

В ней можно выделить три стадии:

1. Стадию инициации (когда PCR-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой).

2. Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла PCR).

3. Плато (стадию насыщения).

Экспоненциальная стадия PCR описывается уравнением:

Pn = P0 * E

n

(1) ( www.molbiol.ru),

где Pn - количество молекул продукта/репортерной флуоресценции к циклу n, P0 - исходное количество молекул, содержащих амплифицируемый фрагмент (template), E - эффективность амплификации. В идеальных условиях E = 2, т.е. на каждом цикле цепной реакции происходит удвоение количества продукта.

Прологарифмируем обе части уравнения 1 и преобразуем его к виду:

n

= - (1/log E) * log P0 + log Pn/log E

(2) ( www.molbiol.ru)

Назовем пороговым циклом (threshold cycle, C(T)) такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции - пороговая флуоресценция PC(T)=const. Для n=C(T) уравнение 2 принимает вид:

C(T)

= - (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E

(3) ( www.molbiol.ru),

т.е. значение С(T) прямо пропорционально логарифму количества субстрата (по материалам www.molbiol.ru) Таким образом, real-time PCR позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций [19].

Базовый уровень флуоресценции.

Это тот уровень флуоресценции, который наблюдается в реакционной смеси до появления репортерного сигнала. Как правило, управляющие программы real-time PCR позволяют задать базовый уровень несколькими способами. Необходимо выбрать такой способ, при котором:

1. Обеспечивается минимальный уровень флуоресценции до появления репортерного сигнала.

2. Начало экспоненциальной фазы детектируется с наибольшей точностью.

В общем случае, базовую линию следует выбирать как среднее значение флуоресценции в достаточно широком диапазоне циклов до появления репортерной флуоресценции (т.е. до начала детекции экспоненциальной фазы). При выборе диапазона желательно также избегать и циклы вне экспоненциальной фазы, в которых наблюдаются скачки флуоресценции.

Для SYBR Green, как правило, хорошо работает расчет базового уровня по среднему значению в диапазоне циклов с 3 по 7 (первые 2 цикла не влючают в диапазон, поскольку на них может наблюдаться более сильная флуоресценция из-за недостаточно стабилизировавшейся реакции).

Более осторожно нужно выбирать базовую линию при TaqMan

амплификации, поскольку к началу PCR в смеси может наблюдаться довольно высокий уровень флуоресценции от "сломанных проб" (в которых произошла диссоциация маркера от тушителя). Если "сломанные пробы" не превалируют, это не представляет большой опасности, и базовая флуоресценция постепенно сходит на нет (обычно к 3-7 циклу). Как уже было сказано выше, в таком случае начальный цикл диапазона нужно выбирать такой, в котором флуоресценция от "сломанных проб" уже достигла минимума

Сравнение динамики развития фитопланктона за 2007-2008 года
В качестве сравниваемого материала служат 7 проб, взятых в 2007 году и 18 проб 2008 года, собранных в период с мая по октябрь. В мае 2007 года наблюдалось более интенсивное развитие фитопланктона. По сравнению с численностью водорослей 1,95*109кл/м³ в 2007г в начале и середине месяца в 2008 году наблюдался уровень вегетации 0,819* ...

Динамика роста и потребления глюкозы и ЭДТА бактериальным штаммом LPM-4
Данные об изменении плотности биомассы, рН, концентрации ЭДТА и аммония в различных вариантах сред представлены в таблицах 1-8. Во всех вариантах опыта деградация ЭДТА отмечалась уже на 1 сутки роста и заканчивалась на 3 сутки, независимо от присутствия глюкозы в среде. Таким образом, можно сделать заключение, что присутствие косубстра ...

Профилактическое использование
Фагопрофилактика — специфическая профилактика бактериальных инфекционных болезней в эпидемических очагах путем применения бактериофагов лицам с высоким риском заражения. Убедительно показано, что при появлении в детских садах, яслях, школах дизентерийной инфекции использование препаратов фага предотвращает заболевание детей, имевших ко ...