Кинетические параметры
Страница 3

- это установка порога таким образом, чтобы превышение порогового уровня над базовым уровнем (threshold над baseline) было достаточно малым, но уже статистически достоверным. Обычно выбирают значения в диапазоне 8-10 стандартных отклонений. Недостатком такого метода является то, что поскольку стандартное отклонение - это усредненная величина по всей кинетической кривой, в каких-то конкретных случаях порог может оказаться слишком низким (когда реакция еще не "устаканилась") или, наоборот, слишком высоким (когда уже наблюдаются какие-то отклонения). Этих недостатков лишен следующий метод выбора порога - по второй производной кинетической кривой

. В таком случае, из всех скачков уровня флуоресценции за пороговый уровень выбирается наиболее резкий скачок - абсолютный максимум второй производной. Этот способ наименее чувствителен к способу выбора базовой линии и различиям условий реакции (по материалам www.molbiol.ru).

Анализ кривой плавления

. Оценку качества реакции проводят по специфичности амплификации, определяемой из кривой плавления (для SYBR Green).Кривая должна быть построена в диапазоне температур от температуры отжига (при более низких температурах это делать не имеет смысла) до температуры полной денатурации - примерно 95OC. Для этого после окончания ПЦР реакционную смесь нагревают и непрерывно измеряют флуоресценцию. По достижении температуры плавления продукта амплификации флуоресценция резко снижается.

Рис. 6

. Пример кривой плавления [7].

Каждое резкое уменьшение флуоресценции на графике соответствует числу полосок, получаемых на электрофорезе, то есть числу разных типов ампликонов. Для облегчения работы с полученной информацией проводят дифференциальный анализ кривой плавления. Такой способ визуализации полученных данных гораздо удобнее для понимания и анализа.

Применение кривых плавления не ограничивается только детекцией продуктов амплификации с помощью бромистого этидия и SYBR Green I. При использовании кривых плавления в системах с ДНК-зондами (Taq-man assay, beacons) возможно различать точечные мутации, расположенные внутри областей связывания ДНК-матрицы и зонда. Наличие таких мутаций способно привести к изменению температуры плавления зонда и к изменениям в графике кривой плавления [11]. Использование кривых плавления не требует от оператора амплификатора никаких дополнительных манипуляций с пробирками, а интерпретация полученных данных автоматизирована и формализована.

В идеальном случае, в реакциях с матрицей мы должны наблюдать один пик (соответствующий плавлению специфического продукта), а контроль "праймеры без ДНК" - слабые, затухающие стохастические колебания во всем диапазоне температур.

Обработка данных.

Методы обработки данных real-time PCR основаны на применении уравнения (3).Основной принцип обработки данных Real-time PCR – это - метод калибровочного графика.

Этот метод предполагает построение калибровочного графика в координатах C(T) - log P0 с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата (P0) в экспериментальных образцах.

Точность метода зависит от того, насколько условия PCR (и, прежде всего, эффективность амплификации) серии стандартов близки к условиям PCR экспериментальных образцов. Поэтому при выборе стандартов необходимо руководствоваться следующими правилами:

а) сдержание примесей в стандартном препарате должно быть сходно с таковым в экспериментальном препарате;

б) для амплифицируемого фрагмента в стандартной ДНК должна быть близка к таковой в экспериментальной ДНК;

Страницы: 1 2 3 4


История возникновения и развития гидробиологии
Истоки гидробиологии восходят к самым ранним эпохам человеческой культуры, когда начали накапливаться сведения об образе жизни водных организмов, в первую очередь тех, которые использовались в пищу или для других целей. Разрозненные экологические сведения о водных организмах нередко встречаются в древней индийской и китайской литературе ...

Дифференциальная активность генов в онтогенезе
Дифференцировка – возникновение различий между клетками, тканями, органами. До 7 дня зигота тотипотентна, т.е. из любой её кл можно вырастить целый организм или орган. После 7 дня тотипотентность теряется из-за дифференцировки. Все структурные кл условно делят на 3 типа: 1) гены “домашнего” хоз-ва – работующего во все кл организма; 2) ...

Семенное размножение рододендронов
Растущие виды размножают семенами, а сортовые только вегетативно − черенкованием, прививками, отводками и делением куста. Это обеспечивает сохранность ценных качеств растений, что не всегда удается при семенном размножении. Однако способы вегетативного размножения достаточно сложны и не всем доступны [1]. Из литературных источник ...